IGEM design: DDT-Soil Profiling and Remediator kit!


DDT (Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane) adalah salah satu pestisida sintetik yang banyak digunakan dalam dunia pertanian. Insektisida ini merupakan insektisida paling ampuh yang pernah ditemukan dan digunakan manusia untuk membunuh serangga, tetapi juga paling berbahaya bagi umat manusia, sehingga dijuluki “The Most Famous and Infamous Insecticide”. DDT termasuk ke dalam insektisida organochlorine, yang sangat hydrophobic, berwarna putih, berbentuk kristal dan berbau kimia. DDT tidak dapat diperoleh secara alami, namun dihasilkan melalui reaksi khloral (CCl3CHO) dengan chlorobenzene (C6H5Cl) dalam asam sulfur, yang bertindak sebagai katalisator. Senyawa DDT merupakan isomer dari 1,1,1-trichloro-2,2-bis-(p-chlorophenyl) ethane.

200px-DDT-from-xtal-3D-vdW

Menurut Rachel Carson (1962) dalam bukunya Spring, menjuluki DDT sebagai obat yang membawa kematian bagi kehidupan di bumi. Karena bahayanya tersebut, rekomendasi EPA (Environmental Protection Agency) Amerika Serikat pada tahun 1972 DDT dilarang digunakan. Pengaruh buruk DDT terhadap lingkungan  sudah mulai tampak sejak awal penggunaannya pada tahun 1940-an, yaitu dengan menurunnya populasi burung elang sampai hampir punah di Amerika Serikat. Dari pengamatan, ternyata elang terkontaminasi DDT dari makanannya (terutama ikan sebagai mangsanya) yang tercemar DDT.  DDT menyebabkan cangkang telur elang menjadi sangat rapuh sehingga rusak jika dieram. Dari segi bahayanya, oleh EPA DDT digolongkan dalam bahan racun PBT (persistent, bioaccumulative, and toxic) material.Dalam ilmu lingkungan, DDT termasuk dalam urutan ke-3 dari polutan organik yang persisten (Persistent Organic Pollutants, POP), yang memiliki sifat-sifat berikut:

  • tak terdegradasi melalui fotolisis
  • berhalogen (biasanya klor)
  • daya larut dalam air sangat rendah
  • sangat larut dalam lemak
  • semivolatile
  • di udara dapat dipindahkan oleh angin melalui jarak jauh
  • bioakumulatif
  • biomagnifikatif (toksisitas meningkat sepanjang rantai makanan)

Berikut ini merupakan dua sifat buruk yang menyebabkan DDT sangat berbahaya terhadap lingkungan hidup adalah:

  1. Sifat apolar DDT. DDT tidak larut dalam air, tapi sangat larut dalam lemak. Makin larut suatu insektisida dalam lemak (semakin lipofilik) semakin tinggi sifat apolarnya. Hal ini merupakan salah satu faktor penyebab DDT sangat mudah menembus kulit.
  2. Sifat DDT yang sangat stabil dan persisten. DDT sukar terurai sehingga cenderung bertahan dalam lingkungan hidup, masuk rantai makanan (foodchain) melalui bahan lemak jaringan mahluk hidup.

DDT dapat terakumulasi di dalam tanah, air dan udara. Kandungan DDT di dalam tanah berkisar antara 0.18 sampai 5.86 parts per million (ppm), sedangkan sampel udara menunjukkan kandungan DDT  0.00001 sampai 1.56 microgram per meter kubik udara (ug/m3), dan di perairan (danau) kandungan DDT dan DDE pada taraf 0.001 microgram per liter (ug/L).  Karena sifatnya yang stabil dan persisten, DDT bertahan sangat lama di dalam tanah; bahkan DDT dapat terikat dengan bahan organik dalam partikel tanah.Gejala keracunan akut pada manusia adalah paraestesia, tremor, sakit kepala, keletihan dan muntah. Efek keracunan kronis DDT adalah kerusakan sel-sel hati, ginjal, sistem saraf, sistem imunitas dan sistem reproduksi. Efek keracunan kronis pada unggas sangat jelas antara lain terjadinya penipisan cangkang telur dan demaskulinisasi.

DDT-3D-balls

Departeman Pertanian RI telah melarang penggunaan DDT di bidang pertanian dan kesehatan pada tahun 1995.  Komisi Pestisida RI juga sudah tidak memberi perizinan bagi pengunaan pestisida golongan hidrokarbon-berklor (chlorinated hydrocarbons) atau organoklorin. Permasalahan saat ini adalah, walaupun secara undang-undang telah dilarang, disinyalir DDT masih juga secara gelap digunakan karena keefektifannya dalam membunuh hama serangga. Hal ini tentunya dapat mengakumulasi jumlah DDT pada ekosistem.

Untuk mengeliminasi bahan racun, biasanya dilakukan berbagai cara seperti secara termal, biologis atau kimia/fisik. Teknik eliminasi DDT secara termal seperti insinerasi memerlukan biaya sangat tinggi, sedangkan cara stabilisasi/fiksasi (racun diinaktivasi melalui enkapsulasi mikro dan makro untuk menurunkan daya larut) masih harus “dibuang” ke landfill yang “aman”. Namun dengan carastabilisasi/fiksasi ini, potensi racun DDT masih tetap bertahan untuk waktu yang lama.

Pseudxanthomonas sp. strain wax merupakan salah satu mikroorganisme tanah yang dapat mendegradasi DDT pada tanah. Mikroorganisme ini memiliki sejumlah gen yang terlibat dalam metabolisme DDT. Potensi mikroorganisme ini dapat dikembangkan menjadi mikroorganisme yang tidak hanya meremediasi, tetapi juga dapat memprofilkan tanah yang mengandung DDT. Jika suatu mikroorganisme mengandung gen yang terlibat dalam metabolisme suatu senyawa, artinya mikroorganisme ini mengandung elemen genetik berupa promoter yang sensitif terhadap keberadaan DDT.

Rancangan sintetik biologi yang saya ajukan adalah DDT-Soil Profiling and Remediator kit. Kit ini merupakan sebuah alat yang dapat memprofilkan apakah suatu tanah mengandung DDT atau tidak, sekaligus meremediasi DDT. Kit ini berbentuk powder berwarna putih yang mengandung Pseudxanthomonas sp. strain wax inaktif yang sudah direkayasa secara molekuler. Berikut ini merupakan mekanisme yang diharapkan dari Pseudxanthomonas sp. strain wax yang sudah direkayasa adalah sebagai berikut:

Capture

Sensor: mengandung promoter yang sensitif terhadap keberadaan sinyal kimia yang diinginkan.

Sensitivity tuner: mengandung gen pengkode protein phage activator dan promoter yang sensitif terhadap phage activator. Dengan input senyawa kimia tertentu, gen phage activator akan ditranskripsi. Setelah translasi untuk menghasilkan protein phage activator, protein ini akan berikatan pada promoter yang sensitif terhadap phage activator, untuk selanjutnya mengaktivasi transkripsi.

Colour generator: mengandung seperangkat elemen genetik dan gen yang berperan dalam menghasilkan warna sebagai output keberadaan senyawa kimia.

Remediation: mengandung gen yang berperan dalam metabolisme senyawa kimia yang dideteksi. Outputnya berupa protein/enzim yang berperan dalam metabolisme senyawa kimia input.

DDT akan berfungsi sebagai sinyal bagi promoter yang sensitif terhadap keberadaan DDT. Promoter ini terdapat pada genome Pseudxanthomonas sp. strain wax. Keberadaan DDT ini akan menginduksi terekspresinya gen pag activator, sehingga menghasilkan protein activator untuk Psid promoter. Kedua sistem activator dan promoter sensitif terhadap activator ini berfungsi sebagai sensitivity tunner, yaitu yang akan mengatur ekspresi dari gen target. Yang diharapkan adalah semakin banyak kadar DDT yang terdeteksi, maka semakin tinggi ekspresi gen pag activator, sehingga semakin banyak protein activator yang dihasilkan. Protein pag activator ini kemudian akan berikatan dengan Psid promoter, sehingga akan menginduksi ekspresi gen target, dalam hal ini adalah gen AmilGFP. Gen AmilGFP merupakan gen pengkode chromoprotein berwarna kuning. Gen ini diperoleh dari biobricks dengan accession code BBa_K592010. Besarnya kadar DDT yang terdeteksi akan mempengaruhi besarnya ekspresi gen AmilGFP. Transkripsi dilanjutkan, sehingga menghasilkan protein LasR. Protein ini akan menginduksi promoter LasI, sehingga transkripsi DDT-metabolism coding gene terjadi. Protein/enzim yang berperan dalam metabolisme DDT dihasilkan. Salah satu enzim yang berperan adalah DDT Dehydrochlorinase (Glutathione S-transferase 1-1). Enzim ini dapat mendegradasi DDT.

Berikut ini skema gen yang diharapkan dari hasil rekayasa:

skema

BBa_B0030: RBS (Ribosomal Binding Site), lebih kuat dari pada BBa_B0034

BBa_B0034: RBS (Ribosomal Binding Site)

BBa_I746351: pag activator  gene from PSP3 phage. Mengkode protein aktivator untuk Psid promoter.

BBa_B0010: Transcriptional terminator (untuk menghentikan proses transkripsi)

BBa_I746364: merupakan Psid promoter yang diperoleh dari genome P4 phage. Promoter ini diinduksi oleh beberapa aktivator, salah satunya adalah PSP3 pag (I746351) (pag activator  gene from PSP3 phage).

BBa_J64010:merupakan lasI promoter yang diperoleh dari genome Pseudomonas aeruginosa. Diaktivasi oleh protein LasR. Promoter ini 4x lebih kuat dibandingkan dengan lasB promoter.

BBa_C0079: LasR protein-coding gene, mengkode lasR activator. Gen ini diperoleh dari  P. aeruginosa PAO1(+LVA)

DDT metabolism-coding gene: gen yang mengkode protein/enzim yang berperan dalam metabolisme DDT. Gen ini diperoleh dari Pseudxanthomonas sp. strain wax.

Output product yang direncanakan:

Kit ini akan dibuat dalam bentuk powder (bubuk) yang mengandung Pseudxanthomonas sp. strain wax inaktif. Pseudxanthomonas sp. strain wax akan teraktivasi jika sudah dicampurkan dengan tanah yang akan diuji yang di dalamnya mengandung DDT.

powder

Sekian kg tanah akan dicampurkan dengan DDT-Soil Profiling and Remediator kit, kemudian akan diinkubasi selama beberapa jam untuk dilihat apakah mengandung DDT, terlihat dari warna kuning yang terbentuk. Inkubasi dilanjutkan selama 20 hari untuk mendapatkan tanah yang sudah tidak mengandung DDT, terlihat dari warna kuning yang sudah hilang.

Pseudxanthomonas sp. strain wax dapat mendegradasi 20 mg kg-1 DDT pada tanah tanah steril dan non-steril dalam 20 hari. Dalam konsentrasi 100 glukosa l-1 dapat menurunkan lebih dari 95% dari total DDT, pada konsentrasi 20 mg l-1, dalam 72 jam dan dapat menurunkan lebih dari 60% dari total DDT, pada konsentrasi 100 mg l-1, di 144 jam.

 

REFERENSI

Aislabie, J.M.; Richards, N.K.; Boul, H.L. 1997. Microbial degradation of DDT and its residues-a review. NZ. J. Agric. Res. 40(2), 269-282.

Cuany, A., Pralavorio, M, et al. 1990. Characterization of microsomal oxydative activities in a wild-type and in a DDT resistant strain of Drosophila melanogaster. Pesticide Biochem. Physiol. 37, 293302.

Dale, W.E.; Copel, M.F.; Hayes, W.J. 1985. Chlorinated pesticides in the body fat of people of India. Bull. World Health Org. 33, 471-477.

Guangli Wang; Ji Zhang, et al. 2010. Co-Metabolism of DDT by The Newly Isolated Bacterium, Pseudoxanthomonas sp. wax. Brazilian Journal of Microbiology 41: 431-438.

Kannan, K.; Tanabe, et al. 1992. Persistent organochlorine residues in food stuffs from India and their implications on human dietary exposure. J. Agric. Food Chem. 40,518-524.

Lal, R.; Dhanraj, P.S.; Narayanarao, V.V.S. 1989. Residues of organochlorine insecticides in Delhi vegetables. Bull. Environ. Contam.Toxicol. 42, 45-49.

Metcalf, R.L. 1973. A century of DDT. J. Agric. Food Chem. 21, 511-519.

Wang GL, Bi M, Liang B, Jiang JD, et al. 2011. Pseudoxanthomonas jiangsuensis sp. nov., a DDT-degrading bacterium isolated from a long-term DDT-polluted soil. Curr Microbiol. Jun;62(6):1760-6.

 

—————————————————————–

my synthetic biology design, road to IGEM 2013!

love genetic engineering soooo much :*

Advertisements

One thought on “IGEM design: DDT-Soil Profiling and Remediator kit!

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s